如何有效預防細胞培養過程的支原體污染

摘要：引起培養細胞污染的微生物有細菌、霉菌、黑膠蟲、支原體等，其中支原體是常見的污染物。本文列舉了一種我國藥典認可的常見檢測手段，也提出了行之有效的預防和解決辦法。

關鍵字：細胞培養；實驗室；支原體；預防；解決

細胞培養是一種體外增殖細胞的常規實驗技術，目前被廣泛用于教學、實驗室和臨床實驗。污染控制是細胞培養能否成功的關鍵所在。引起培養細胞污染的微生物有細菌、霉菌、黑膠蟲、支原體等，其中支原體是常見的污染物。

支原體屬于缺乏細胞壁的原核微生物，直徑約0． 13 ～0． 18 μm，大小介于細菌和病毒之間，可透過一般濾膜(0． 22 μm)，因此在細胞培養過程中，細胞極易受到支原體污染。已有許多調查及研究顯示，世界范圍內正在使用的細胞體系中支原體污染發生率達到 30% ～60% 。中國醫學科學院基礎醫學研究所檢測過的國內來源的細胞株系，支原體污染率高達 60% 。

支原體感染發生后培養液清澈不渾濁，但 pH 值變化明顯，培養液更換后幾小時內變為酸性(顏色變黃)。污染初期，顯微鏡高倍鏡下觀察發現細胞外形無明顯變化但有細小黑色顆粒，所以不容易被發現。雖然支原體可以與細胞長期共存，且隨著細胞換液而緩解，但細胞遭受支原體污染后會抑制細胞生長，改變細胞的 DNA /RNA 及蛋白表達，使細胞的轉染效率大大降低，并在污染后期引起細胞變形，對后續教學、科研產生嚴重影響。因此在細胞培養過程中進行支原體檢測十分必要。

一、檢測手段

熒光染色法：將待測細胞分別培養于Φ3 cm培養皿中，細胞長到 70% ～ 80% 時進行熒光檢測。首先，各組細胞用 PBS 清洗 2 次，每次1 min，4%多聚甲醛(PBS 配制)室溫固定 20 min，再以含5 μg /ml Hoechst 33342 染料的 PBS 溶液進行染色，5 min 后吸去染液，PBS 洗滌一次，加入少量 PBS 使細胞保持濕潤，在熒光顯微鏡下觀察細胞。

二、檢測結果

Hoechst 33342 是一種可透過細胞膜并對 DNA染色的細胞核染色試劑。熒光染色法檢測支原體污染，就是利用 Hoechst 33342 可與雙鏈 DNA 結合，在紫外光的激發下，釋放強烈的藍色熒光這一特點對細胞加以染色。經過染色，在熒光顯微鏡下，可見待測細胞1 的細胞周圍或細胞膜上有大小不等、不規則熒光著色顆粒，推測為支原體污染細胞(圖 1)，而待測細胞2 只有細胞核顯色，推測為未污染細胞(圖 2)

三、控制辦法

1.保持操作環境清潔: 無菌室的濾膜要定期清洗和更換;每次進行細胞培養操作前，無菌室和超凈臺都要用諾福消毒劑消毒滅菌;每次實驗完畢要用消毒劑浸泡的抹布擦拭操作臺，避免交叉污染;定期對二氧化碳培養箱進行消毒滅菌。

2.實驗用品無菌處理: 所有用品都要經過高溫消毒滅菌;培養基、血清、胰酶等試劑均要經過檢測確定無支原體污染后方可使用。

3.操作者遵守無菌室消毒規定: 由于正常人口腔帶有支原體，因此進入無菌室一定要帶好口罩、帽子(口罩必須罩住口鼻，帽子必須將頭發全遮在里面)，鞋套，穿隔離衣，帶乳膠手套，并用 75% 酒精擦拭手套表面。

4. 操作過程嚴格按照無菌操作要求: 開始要先用 75%用精棉球擦拭瓶口，在火焰上燒灼瓶口，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，瓶口要再次轉動燒灼 ;操作時盡量不要講話;要常更換吸管，一旦發現吸管觸及手和其他物品應棄去。所有操作過程要在距離超凈臺邊緣 10 cm 以內的無菌區域進行。

5. 定期進行支原體污染檢測 : 對實驗室中的培養物定期進行支原體檢測，預防為主，不能等到發現有支原體污染時再進行檢測，發現已經污染支原體的培養物，滅活后棄之，嚴禁隨意傾倒、隨意丟棄。及時更換新的培養物，避免支原體污染。

四、常規方法

很多生物安全實驗室一直使用歐菲姆干霧過氧化氫滅菌設備，能迅速有效的殺滅支原體，減少日常維護和清潔的時間。作為一種新型的實驗室消毒產品，歐菲姆干霧滅菌設備，具備實驗室空間消毒滅菌的眾多優勢：

1.高效消毒滅菌：能夠迅速殺滅病原菌（支原體、衣原體、立克次氏體）、芽孢在內的200多種微生物，滅菌原理特殊無耐受性產生；

2.設備體積小，操作方便，靈活移動滿足不同空間需求，便于攜帶和移動；

3.品質保證，擁有眾多檢測批文和檢測報告

4.無色無毒，無殘留，安全可靠，完全分解為氧氣和水；

5.驗證資料齊全，提供驗證模板，容易通過高標準滅菌驗證；

6.殺菌時間超短，2-3個小時可完成整個滅菌流程，高效節能；

7.干霧氣體性能穩定，不受環境濕度、溫度、活性穩定攻擊微生物活體；

8.性價比高，節約消毒成本。

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